好不容易会做了实验，读懂了结果图，做出来的结果却千奇百怪，也不知道是哪里出了问题。今天就给大家整理了CO-IP常见的6大异常条带，逐一分析了造成的原因以及改进办法！

1.在IP实验过程中，检测到的相互作用蛋白的信号较弱？

(1)原因：经分析，存在表达量过低的情况，同时目的蛋白的识别表位可能被互作蛋白所遮盖，以及在实验洗涤过程中目标蛋白可能发生丢失。

(2)改进：

① 为确保实验的准确性，建议在做WB前，首先验证蛋白表达量，并据此提高上样量，或用互作蛋白含量较高的样本进行实验，以确保蛋白的有效检测。

② 选择高亲和力的抗体（IP级别抗体）进行实验，以提高对目标蛋白的识别效率。

③ 在实验开始前，需确定合适的去垢剂和盐离子浓度，以避免在洗涤过程中目标蛋白的丢失，确保实验结果的可靠性。

2.在IP实验中，背景信号偏高或者检测到了非特异性的信号？

(1)原因：

① Beads的非特异性结合。

② 非特异性蛋白与Beads结合。

③ 抗体浓度过高或特异性不佳。

④ 样本降解。

(2)改进：

① 建议在使用前使用1~5%的BSA进行预封闭处理。

② 免疫沉淀后，应增加漂洗次数和盐离子浓度，以有效减少非特异性结合。

③ 选择合适抗体类型并调整其使用浓度，以减少非特异性结合。

④ 裂解样本时，加入蛋白酶抑制剂或确保样本新鲜制备，以避免样本降解对实验结果的影响。同时，投入适量的样本量，避免样本过多导致的背景信号增强。

3.在Input泳道中未检测到目标蛋白条带，而在IP组中检测到了目标蛋白条带？

(1)原因：目标蛋白在样本中的丰度较低或存在降解现象，这导致在Input组中未能成功检测到该蛋白，而在IP组经过富集后能够检测到。

(2)改进：为了提升实验的准确性，建议进行常规的WB验证，并在样本处理阶段添加蛋白酶抑制剂以稳定蛋白质。同时，建议适当提高Input组的上样量，以增加检测到目标蛋白的机会。

4.在Input泳道中没有发现预期的蛋白条带，同时在在IP组中也没有观察到任何信号？

(1)原因：样本降解以及样本蛋白丰度低，导致实验效果不佳。

(2)改进：

① 为防止样本降解，建议在冰上进行样本操作，并在裂解样本时加入蛋白酶抑制剂，尽量多地保留样本中的蛋白质。

② 针对样本蛋白丰度低的问题，若当前样本量无法检测到足够的蛋白，建议提高样本量，以确保实验结果的准确性和可靠性。

5.在Input泳道中观察到了目标蛋白条带，但在IP组中，要么没有检测到信号，要么目标蛋白条带的信号较弱？

(1)原因：

① 样本中抗原含量不足，导致抗体难以与其结合进行有效检测；

② 抗体本身的亲和力较低，也是影响检测效果的关键因素之一；

③ IP抗体未能成功与磁珠结合，进一步影响了检测结果的准确性。

(2)改进：

① 建议采用IP级别的抗体，因为一般而言，IP实验相对于WB实验需要更高亲和力的抗体以提高检测效率。

② 建议选择浓度较高的抗体或增加抗体的使用量。

③ 增加抗体与磁珠的孵育时间，以确保充分结合。

④ 请确保磁珠的正确保存，避免其变质或干燥，以确保实验结果的可靠性。

6.蛋白质分子量与轻重链相近或相同，难以进行区分？

(1)原因：在IP变性洗脱过程中，抗体在高温和还原剂的影响下，会发生变性，进而分解为轻链和重链。

(2)改进：建议采用IP专用的构象二抗，该抗体仅针对目的蛋白具有识别能力，从而避免了轻重链的干扰。此外，若条件允许，可尝试使用不同种属的一抗（需额外购买两种抗体以满足实验需求）。对于WB实验，建议使用直标一抗，但需注意直标一抗可能因无二抗信号放大作用，而导致信号较弱或无法曝光的情况。

文章出自：细胞实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/